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乳酸克鲁维酵母Cu_Zn-SOD 基因的克隆及在酿酒酵母中的表达研究

乳酸克鲁维酵母Cu_Zn-SOD 基因的克隆及在酿酒酵母中的表达研究

中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(8):6066

乳酸克鲁维酵母Cu/ZnSOD基因的克隆及

在酿酒酵母中的表达研究

,2,2

李文凤1 季 静1 王 罡1 牛宝龙1 王海勇1

(1天津大学农业与生物技术学院 天津 300072 2天津大学化工学院 天津 300072)

摘要 根据Genbank中乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)的Cu/ZnSOD基因序列设计引物,通过PCR扩增得到Cu/ZnSOD基因。在PGK1启动子驱动下,将该基因与荧光报告基因GFP融合,分别构建重组质粒YEplac195PSGA和YCplac33PSGA,并转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)W303CR和荧光显微观察证实乳酸克鲁维酵母(Kluyveromycesα菌株。通过菌落Plactis)的Cu/ZnSOD基因在W3030mmol/L百草枯α中成功表达。将获得的阳性转化子在添加2的发酵培养基中进行发酵,SOD的比活力和总活力分别是不添加百草枯培养基中发酵菌体的6.7倍和4.7倍。通过热激胁迫处理进一步探讨Cu/ZnSOD对宿主sod1G118耐受Δ酿酒酵母菌株EG118(YEplac195PSGA)>EG118(YCplac33PSGA)>力的影响,结果显示抗热击能力的顺序为EEG118。以上结果为发酵工业中防止菌体老化和增强菌体的发酵能力提供一定的理论指导,也为u/ZnSOD体外分子定向进化改造奠定必要的基础。后续的C

关键词 铜锌超氧化物歧化酶 酿酒酵母 表达 百草枯 菌种老化

中图分类号 Q785 Q786

  超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,EC1.15.1.1,SOD)是一种广泛存在于生物界的金属酶,在生物

1]

体内的抗氧化防御系统中处于核心地位[。SOD是活

5]

,但在衰老相关领域则鲜有报道。在于抗逆性方面[

发酵生产工艺中,易受各种培养条件如高温等影响,导致菌种老化现象,降低产率和产品质量。国内对菌种老化研究的报道较少,因此通过基因工程手段对菌种在不利环境下SOD的生理功能与抗氧化机理作进一步研究,对探讨发酵过程中菌种老化机理及其调控具有重要实践意义。

  酿酒酵母是目前研究背景最清楚的单细胞真核生物,由于其近乎完整的基因组信息、较完善的遗传操作体系,易培养,繁殖快,因此被用作研究真核生物的模式生物。本文以酿酒酵母为宿主,乳酸克鲁维酵母菌Cu/ZnSOD基因为研究对象,通过基因工程手段使乳酸克鲁维酵母菌Cu/ZnSOD基因在酿酒酵母工业菌株W303并通过添加百草枯(paraquat,PQ)和热α中表达,

6]

激胁迫使菌体产生大量超氧阴离子[,进而对其生物

性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)清除系统中第一道防线,它催化超氧化物阴离子(O)发生歧化反应生成OO,是一种能专一清除超氧阴离子自由基2和H22的金属酶

[2]

·

[2]

。根据其活性部位结合金属离子的不同,

可分为Cu/ZnSOD、MnSOD和FeSOD。其中,Cu/ZnSOD在生物体内分布最广,稳定性最高,具有重要的生理学意义和实用价值。

  随着分子生物学的发展,SOD基因已经从多种微生物、动物、植物等生物中得到克隆表达

[4]

[3]

,并且有部分在

大肠杆菌、酵母、病毒、昆虫、哺乳动物、植物等中得到

。目前国内SOD的相关基因工程研究主要集中

收稿日期:20100412  修回日期:20100511

2009ZX08003019B)、国家转基因生物新品种培养重大专项(

(2008ZX08003005)、(2008ZX08004001)、(2009ZX08010013B)资助项目

电子信箱:jijingtju@live.com通讯作者,

活性和在极端条件下对宿主的耐受能力的影响进行了研究。为今后发酵工业中防止菌体老化和增强菌体的发酵能力提供一定的理论指导,并为进一步对Cu/Zn

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