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PCR的延伸时间

PCR的延伸时间(网上资料总结)

关于PCR反应的延伸时间(网上资料总结)

①网友:在分子生物学书上看到:延伸时间与产物片段长度有关,产物在1kb以内的延伸时间为1分钟左右,3kb-4kb的需延伸3-4分钟

②引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 ③3400bp的基因PCR时怎样设定程序,尤其是延伸的时间?求指教

这么长的PCR产物需要用特殊的Taq酶(如TAKARA的LA Taq,不知道这个酶是否换生产),普通的Taq酶一般延伸不到这么长。你需要根据Taq酶的延伸速度计算延伸时间(Taq酶的延伸速度一般是几百bp/min,你可以查查你用的Taq酶的延伸速度),延伸时间=产物长度/延伸速度,然后留一些冗余。3400bp至少需要延伸4-5min左右。

你要先看你所用的酶的说明书,上面有该酶的热启动温度,变性温度,延伸温度等等,不同的酶都是不一样的。如果酶的延伸速度是一分钟1kb,那么你就设3.5分钟,如果是半分钟1kb,就设2分钟,就这样。退火温度是看你设计的引物,你把引物放到设计软件上看一看,调整一下buffer的离子浓度,看看退火温度是多少。就可以了。

④延伸时间要足够长,一般按1min/kb延伸。

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