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ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-N

生物工程学报 Chin J Biotech 2008, March 25; 24(3): 509-514 http://doc.xuehai.net Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@http://doc.xuehai.net © 2008 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

江汉民, 柴新君, 何冰, 赵娟, 俞新大

南开大学生命科学学院, 天津 300071

摘 要: 将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。

关键词: 神经生长因子, 表达, 前导肽, 蛋白复性, 生物活性

Expression, Purification and Renaturation of ProNGF in Escherichia coli

Hanmin Jiang, Xinjun Chai, Bing He, Juan Zhao, and Xinda Yu

College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China

Abstract: Nerve growth factor (NGF) promotes neuronal survival and differentiation and stimulates neurite outgrowth. NGF is

synthesized as a precursor-proNGF in vivo. In this paper, a pET-proNGF prokaryocyte expression vector was constructed and transformed into E. coli BL21(DE3)pLysS. The proNGF was expressed in the form of non-active aggregated monomer in E. coli after induction with IPTG. SDS-PAGE revealed the proNGF expression product had a Mr.30.2 kD. Western blotting analysis showed that the protein had good antigenicity. Fusion protein was successfully purified by Ni2+-NTA affinity chromatography and cleaved by Enterokinase and 13.1 mg proNGF was obtained from 100 mL cell culture in a typical experiment. The protein was dialyzed in a redox system containing reduced and oxidized glutathione. RP-HPLC was used to analysis the result of the refolding. The refolded proNGF protein can induce neurite outgrowth of PC12 cells, which indicated that pro-form of NGF we obtained had biological activity.

Keywords: nerve growth factor, expression, propeptide, protein refolding, biological activity

神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)是机体重要的神经营养因子之一, 能促进中枢及外周神

经系统的发育和分化, 维持神经系统的正常功能, 加快神经系统损伤后的修复, 临床上可用于治疗多

Received: July 23, 2007; Accepted: August 29, 2007

supported by: the Natural Science Foundation of Tianjin (No. 033605211).

Corresponding author: Xinda Yu. Tel: +86-22-23505275, E-mail: yuxd@http://doc.xuehai.net 天津市自然科学基金资助(No. 033605211)。

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